细胞培养—NK-92培养的注意事项
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发布时间：2023-01-08 02:32
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时间：2023-10-21 03:15
下面将为同学们详细阐释NK-92细胞特性及培养注意事项。
NK-92细胞生长特性为悬浮生长，收到细胞后先观察瓶身是否完整，无漏液现象，培养基是否澄清透亮，在显微镜下观察细胞；
用75%的酒精擦拭瓶身后将细胞培养瓶先竖立静置2~4个小时，让细胞沉降到底部；细胞静置完后，将瓶中上面部分培养基小心吸出，留底部细胞和3ml左右培养基在原瓶；
吸出的细胞培养基离心收集细胞沉淀，离心转速1000转3分钟，或根据您的离心机实际情况而定，NK-92细胞对离心敏感，转速不宜过高；用2~3mlNK-92完培将得到的细胞沉淀重悬后，放回原瓶继续培养过夜，一个T25培养体积是5~6毫升；
NK-92细胞可按照200U/ml的浓度补加IL-2。
培养瓶为不透气瓶盖，一定要拧松到不掉的程度，使细胞充分透气；培养瓶横放，瓶口拧松透气，培养过夜；
显微镜下观察细胞，视细胞密度和培养基消耗情况，进行传代。不建议直接进行离心操作，因为经过运输颠簸和各种处理，细胞很可能达不到最佳状态。尽量不要吹散细胞团，加完液轻晃培养瓶即可。
NK-92细胞为悬浮生长，大部分细胞聚集成团，少数细胞分散，并且细胞间隙会有较多的死细胞和细胞碎片，且培养过程中经常能观察黑色的颗粒和小黑点，这些黑点大概是细胞带的，一般少量黑点不增殖不会影响细胞的生长，若黑点繁殖生长则怀疑细胞污染，会影响细胞生长，甚至使细胞死亡。
NK-92细胞对IL-2敏感。培养基中IL-2降解，将导致细胞状态变差。IL-2长期保存温度为-20℃，解冻后置于4℃冰箱保存，4℃保存不应超过两周。配制好的新鲜培养基要尽快用完，使用前预热，使用完毕后放回4℃冰箱保存；
NK-92细胞对离心敏感。正常培养时，换液周期为2~3天，建议交替使用半量换液和离心换液法，即半量换液2~3次后，离心全量换液一次。尽量减少离心次数，细胞状态不佳或细胞量少的时候，一般不建议离心。
细胞团块是否需要吹散？
团块需要吹散，但不用刻意吹散成单颗；
正常传代或者离心换液后吹打，控制吹打次数以及力度，即使细胞都分散成单个，也会在1~2天内聚集起来；细胞团太大时，需要分散；
细胞冻存的时候，细胞需要尽量分散，否则影响冻存效果。
(1) 补液法： 每2~3天补加适量（根据培养容器和原来细胞悬液体积来定，T25瓶一次补液1~2毫升即可）新鲜培养基，同时补加200U/mlIL-2，补加2-3次之后，离心全部换液。
(2) 半换液法： 以T25瓶子（瓶中装有5ml培养基）为例，竖起瓶子静置一段时间（竖瓶前轻拍培瓶，让轻贴底部的细胞团浮起来），待细胞沉底（肉眼观察细胞沉底情况），小心吸出2.5ml上清转移到离心管，1000rpm 3~5min离心，离心后的细沉淀用2.5ml新鲜培养重悬后放回原瓶继续培养。细胞生长时，聚集的细胞团会逐渐增大，正常的细胞团在显微镜下呈现白色透亮状。若细胞聚集太多，出现细胞团中部发暗时，可进行传代。
将细胞团用移液器轻轻吹散（一般吹2-3次即可，吹打力度不可过大，否则会出现大量死细胞和细胞碎片），均分到两个瓶子里，每瓶再补充等量完全培养基。
细胞对营养要求很高，细胞量过多时会影响细胞生长；细胞团块过大时，需要稍微吹散，注意控制吹打次数，不需要全部吹散。
推荐使用90%FBS+10%DMSO的冻存液配比，NK-92细胞可适量补加IL-2；尽量吹散细胞，注意控制吹打力度。
细胞复苏操作步骤如下：
复苏后，用6ml新鲜完全培养基，重悬细胞；离心后去除上清用1^2mL完全培养基重悬细胞，注意要少次轻柔吹打。
瓶子竖着放进培养箱，以增加细胞局部密度，瓶盖保持透气；
细胞生长需要稳定的环境，可每天观察1次，不要频繁拿出培养箱观察。
