为什么做western blotting时用脱脂牛奶呢?

发布网友发布时间：2022-04-23 20:24

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热心网友时间：2023-08-29 14:06

Western Blotting是一种用于分析特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的方法。在Western Blotting实验中，脱脂牛奶常常被用作Blocking溶液。下面是为什么使用脱脂牛奶的原因：
1. 阻断非特异性结合位点：在Western Blotting实验中，样品通过电泳分离后，会通过转移膜转移到*纤维素膜或PVDF膜上。然后，抗体将被添加到这些膜上进行反应。然而，抗体可能会与膜上的其他非特异性位点结合，这会干扰实验结果。通过使用脱脂牛奶作为Blocking溶液，可以阻塞这些非特异性位点，从而减少抗体的非特异性结合。
2. 增加样品的溶解性：Western Blotting实验中使用的抗体通常是通过动物免疫产生的。这些抗体通常会在血清中存在，而动物血清是蛋白质的丰富来源。如果直接将抗体添加到膜上，抗体可能会与膜上的其他蛋白质结合，这也会干扰实验结果。通过使用脱脂牛奶作为Blocking溶液，可以将抗体溶解在牛奶中，从而增加抗体的溶解性，并减少与膜上的其他蛋白质的相互作用。
总的来说，使用脱脂牛奶作为Western Blotting实验中的Blocking溶液可以帮助阻塞非特异性结合位点，增加样品的溶解性，从而提高实验的特异性和敏感性。
至于制作步骤，一般包括以下步骤：
1. 准备脱脂牛奶：选择无任何添加剂的脱脂牛奶，将其加热并摇匀，使其充分混合。
2. 准备Blocking溶液：将脱脂牛奶和其他必要的试剂混合在一起，例如Tris-HCl缓冲液和牛血清白蛋白（BSA）。
3. 将Blocking溶液加入到膜上：将Blocking溶液加入到膜上，确保溶液覆盖整个膜的表面。
4. 孵育：将膜在Blocking溶液中孵育一段时间，通常在室温下进行。
5. 洗涤：在孵育结束后，将膜洗涤几次，以去除多余的Blocking溶液和其他未结合的物质。
6. 进行Western Blotting实验：在完成Blocking步骤后，可以进行Western Blotting实验的其他步骤，例如添加一抗、二抗等。
需要注意的是，具体的Blocking溶液配方和孵育时间可能会因实验而异，因此建议根据具体的实验方案进行相应的调整。

热心网友时间：2023-08-29 14:07

膜上有蛋白缺损点，不用蛋白封蛋白缺损点容易出现非特异染色。
也可用BSA封，效果并不比脱脂奶粉好。
脱脂奶粉中主要是乳清蛋白和酪蛋白。原理就是用非抗原的蛋白去封闭膜，避免标记抗体固定在膜上引起背景增高。