急需! 测定脂溶性维生素样品需如何处理?
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发布时间：2022-07-15 00:12
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时间：2023-11-11 13:27
目前维生素A都是合成的，来源：（1）从动物肝脏中得到；（2）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡萝卜素，主要是β-胡萝卜素）
维生素A的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。
对于三氯化锑比色法适用于样品中含VA高的样品，方法简便、快速、结果准确，但是对维生素A含量低的样品，如每克样品中含5~10μg维生素A时，这时样品由于受其脂溶性物质的干扰，不应用比色法测定。
对于紫外分光光度法不必加显色剂显色，可直接测定维生素A的含量，对样品中含VA低的也可以测出可信结果，操作简便、快速。
1、维生素A的性质
⑴ 因有许多不饱和链，故见光易分解；
⑵ 在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时间长短，因为时间长，见光时间长，见光分解，故测出的比出厂的含量要少；
⑶ 对碱稳定；
2、测定步骤
⑴ 样品用有机溶剂萃取脂类
样品可以根据脂肪的测定处理脂肪，即索氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用热苯回流方法提取脂类。如果样品中含蛋白质和淀粉多的情况下可采用乙醚提取法。
⑵脂类的皂化
脂类有维生素和脂肪这两部分通过皂化（50%KOH、无水C2H3OH、热回流）把它们分开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。
皂化条件：
（1）C2H3OH︰脂类 = 8︰1；
（2）KOH量 = 脂量×皂化价（mg）×2.5；
（3）皂化温度与时间：70℃、30分钟
在皂化时可以加入抗氧剂连苯二酚和对苯二酚，防止氧化。
⑶ 提取：不皂化物和皂化物经水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。
⑷ 柱层析分离干扰物质
采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把β-胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素A与β-胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分离开。如果样品中只有维生素A而不含β-胡萝卜素时，这时可直接定容。
维生素A与β-胡萝卜素分离：
吸附剂： 8分中性Al2O3和2分碱性Al2O3混合，装柱
分离方法：a. 用2%丙酮石油醚洗β-胡萝卜素；
b. 用乙醚洗VA。
3、测定方法
⑴ SbCl3比色法
维生素A／CHCl3 ＋ SbCl3／CHCl3→形成兰色物质→在620nm有最大吸光峰
这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。
计算：每百克样品含VA的量= C×（V1/V2）×（100/W）
C ：从标准曲线上查得VA的量
V1 ： CHCl3定容的量
V2 ： 测定所取样液体积
⑵ 紫外分光光度法
a. 原理：
VA为脂溶性的，测定VA时必须先将样品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化部分，在经柱
层析除去杂质等干扰物质，在紫外328nm下测定，求出含量。
b. 方法
1） 提取及皂化
称样10.00g → 于烧杯中 → 加40ml水搅匀 → 移250ml分液漏斗中 → 加氨水5ml → 加乙醇35ml →
摇匀 → 用乙醚抽提（每次40ml抽提三次） → 收集乙醚层 → 用10ml水洗乙醚层三次 →水层再
用30ml乙醚抽提一次 → 合并所用乙醚 → 用索氏法除乙醚→ 待瓶中乙醚除尽后 → 加30ml80%
的KOH → 40mlC2H5OH →加0.8g焦性没食子酸 → 83℃水浴30分钟（皂化脂肪）→ 冷却后移入
250ml分液漏斗中 → 加60ml水 → 用40ml乙醚抽提三次 →合并乙醚抽提液 → 用水洗至中性 →
用索氏法除乙醚 → 除去后用5ml石油醚溶解瓶中内容物 → 然后移入刻度试管中
2）层析
在层析柱内装8cm高度中性氧化铝 → 2cm高度碱性氧化铝及1cm无水硫酸钠 → 以石油醚浸透 → 装皂化后的样液慢慢于柱内→ 用1~2ml石油醚洗试管 → 洗液倒入柱内，活塞打开以每分钟为35滴左右的速度打开，当液面降到接近硫酸钠时 → 加5ml石油醚→ 随后用5ml洗脱液逐次洗涤。
层析柱上第一个*层析层，一般是β-胡萝卜素，此带在12%洗脱液前后洗去，收集于10ml容量瓶中直到流出物不呈*为止，此层可测β-胡萝卜素用，而VA一般在50%洗脱液洗出，用2ml刻度吸管收集1ml。吸约0.2ml于小试管中→加0.3ml25%三氯化锑→溶液如呈兰色→表明有VA存在，故0.5ml用石油醚定容10ml。
3）样液测定
以石油醚为空白
4）计算
VA(I.μ100G)=(E×106×2)/(1830×100×W)×(1000/0.3)
0.3 ：每0.3μg VA相当于1 I.μ
E ： 消光值 W ： 样品重量（g）
1830 ：石油醚中其消光值1%cm为1830
（I.μ）： 一个国际单位，维生素A相当于0.6 μgβ-胡萝卜素。
4、试剂
⑴ 50%KOH；⑵ 无水硫酸钠；⑶ 乙醚（不含过氧化氢）；⑷ 石油醚；⑸ 苯；
⑹ 45%C2H5OH（应不含醛类物质）
酒精中含醛类的检查方法：
首先配银氨溶液，在50%*银溶液中加入浓氨水，直到氧化银沉淀又重新溶解为止，在小试管中加2ml银氨溶液，加3~5滴酒精，摇匀，加10%NaOH 1滴加热，若有银镜反应，表示乙醇中含有醛。
脱醛处理：
取乙醇2000ml → 加AgNO32g → 振摇溶解 → 加NaOH 4g →振摇溶解 → 过滤 → 上清液 → 蒸馏 → 即可
⑺ 20~25% SbCl3的CHCl3
先量取100mlCHCl3于广口瓶中，用减差法称取一定量的干燥SbCl3，SbCl3易吸水，所以必需蒸馏重结晶后使用，一般用沙浴上加热。
二、维生素D
维生素D在鱼肝油和鸡蛋黄等食品中含量较多，一般*不会缺VD，而婴儿容易缺乏。
1、操作步骤
⑴ 提取
样品（奶粉）＋水→混匀 在NH4OH的作用下酪蛋白Ca盐溶解加入乙醇使脂肪球分离→乙醚、石油醚萃取得到脂质（其它样品可用索氏提取得到脂质）
⑵ 皂化
在奶粉中脂溶性物质有VD、β-胡萝卜素、VA、VE、甾醇、脂肪。
目前皂化有三种情况：
低温（室温）
中温（70℃±2℃）
高温（100℃15min）
低碱
低碱
低碱
回收率不完全
回收率46%
回收率70%
低碱 = 脂肪︰KOH为1︰2.5的关系
另外在皂化时加抗氧化剂与不加抗氧化剂回收率不一样，加抗氧化剂的回收率高于不加抗氧化剂的回收率。
有人将上面的皂化条件互补，采用中温-高碱并加抗氧化剂，这样的回收率为96.8%，效果较好。
故皂化条件 ：70℃±2℃高碱 + 抗氧化剂
⑶ 萃取
⑷ 除甾醇
甾醇在食品中含量较多，主要是通过柱子，这个柱子就是毛地黄皂甙。
甾醇 + 毛地黄皂甙 → 沉淀
洗脱液用乙醚︰己烷 = 1︰5配制而成
甾醇︰毛地黄皂甙 = 1︰14 用量
⑸ 皂土柱层析
当VD与VA共存时，须用皂土柱层析除VA及VA的分解产物。
测定方法有两种：
比色法：
维生素A／CHCl3 ＋ SbCl3／CHCl3／乙酰氮 → 形成橙*物质 → 500 nm下测定
紫外分光光度法
VD／乙醇 → 265 nm下测定
参考资料：食品手册
