从土壤中分离产淀粉酶枯草芽孢杆菌
发布网友
发布时间：2022-04-22 06:29
共2个回答
热心网友
时间：2023-09-24 06:13
①制菌悬液：五个土样分别取5g，放入各自装有45mL无菌水的三角瓶，振荡10min,即为稀释10-1的土壤悬浮液。每个环境的土样装1个锥形瓶，共5个，同时将其分为10组，编号ABCDE。
②加热筛选有芽孢的菌：将5个锥形瓶加塞、包扎、摇匀（无菌室里），利用恒温水浴装置100℃左右水浴，水浴锅温度恒定后维持15min（制悬液时就应先开始加热），制成10-1 g/ml的土壤悬液
③梯度稀释菌悬液：再分别另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5。取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌的移液器吸取1mL土壤悬液加入10-2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法从10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5土壤稀释液。
在土壤稀释过程中，用相同的移液*头由浓到稀来稀释。
④涂布平板 用一支新的无菌*头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做3个平板（重复）。37℃下恒温培养24h。
2、复筛方法
【1】
划线接种（分区划线法）：在上述不同稀释度培养基中挑取不同形态的单菌落进行分区划线，先在平板培养基的一边作第1次平行划线3~4条，再转动培养皿约60°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线（如右图）。划线完毕，盖上皿盖，倒置于28~29°C温室中培养约20h.。再继续分区划线2-3次，以获得较纯的菌种。
将纯化得到的单菌落分为两部分，其中一部分接种到培养基内，用以保存菌种，另一部分用来做染色实验。
3、获得产淀粉酶芽孢杆菌纯种：
上述划线接种后的菌落中各挑取形态特征不一致的点接于倒好的淀粉牛肉膏培养基中，一个土样取8个平板两两标记同一位置同序号标记，一平板分5个区域，点接重复两次，在37℃培养箱中培养24h。
上述点接后的平板中取出一组四个分好区域的淀粉牛肉膏培养基平板于实验室，其他置于无菌室。实验室里，四个平板均加入碘液，立即观察记录阳性和阴性菌落所在位置，并可同时记录透明圈的大小。根据所记录的阳性菌的编号，利用另一组中的营养琼脂平板上其对应的菌落继续划线接种，培养后将出现的形态特征不一致的菌落进行编号，然后挑取部分出来进行革兰氏染色镜检，若发现视野内出现形态、大小、颜色一致且为杆菌的菌体，则将其对应的菌种划线接种到新的营养琼脂平板上，标记，37℃下培养24h。否则继续进行划线分离，培养后再经革兰氏染色镜检直至得到纯种杆菌后进行芽孢染色。筛选出芽孢纯种后进行斜面接种。
革兰氏染色步骤： 涂片、干燥及固定
初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。
4
脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。 复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。 镜检：油镜观察染色结果。 芽孢染色染色镜检：
·取37℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌涂片，干燥，固定。 ·于涂片上滴人3～5滴5%孔雀绿水溶液。
·用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 ·倾去染液，待玻片冷却后，水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 ·用石炭酸复红液复染l min，水洗。
·制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。 （注：观察芽孢的形状和位置，查伯杰细菌手册）
4.斜面保存菌种
·贴标签 取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管
斜面的正上方，距试管口2～3cm处。（每种菌接3管，标上相同编号也要与平板上菌落编号相对应）。
进行斜面接种操作，加塞、包扎好到37℃培养箱里培养24h。
5、菌种的鉴定
5.1所得的斜面菌种接种到新的平板上培养以观察筛选出的产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿情况、形态 、高度 、透明程度、边缘、是否易被挑起、气味等。然后进行一系列的镜检——革兰氏染色、芽孢染色（具体步骤同上）观察是否符合附表中芽孢杆菌的指标 5.2生理生化试验
温度对菌种培养的影响；淀粉水解试验；温度对菌种的影响；明胶液化试验；糖发酵试验；乙酰甲基甲醇试验(V.P试验)；吲哚试验；耐盐性试验；柠檬酸盐利用试验。 ·温度对微生物生长的影响
将牛肉膏蛋白胨培养基熔化倒平板。（培养基厚度为一般培养基的1.5 到2倍）
取30 套牛肉膏蛋白胨平板，分别进行标号。 在上述各平板中分别划线接种不同的菌种，每个菌种重复接种六个平板。各取每个菌种两套平板倒置于4℃ （冰箱）、37℃（或者室温），60℃下保温培养24 小时，观察细菌的生长状况。（“—”不生长，“+”生长较差 ， “++”生长一般，“+++”生长良好。 ·淀粉水解实验
以18-24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区划“+“字接种，）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1℃培养24-48h，或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养
5
基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。
·糖类发酵试验（葡萄糖、木糖和乳糖发酵）
用小砂轮轻轻切割发酵管没有标签和标识的另外一端，注意保留标签和糖的名称。用接种针将各种杆菌分别接种于两种发酵管内，每种发酵管重复两次，标记，要与斜面菌种标记相对应。两种发酵管各设一支不接种，作为空白对照。注意接种的整个过程中，不能人为的制造气泡，若发酵管内有气泡，则轻轻甩动发酵管直至气泡消失。若气泡不能退去，则该管作废应重做一管。接种后，每一管外包一层无菌纸，以防污染。接种完毕后，将全部发酵管倒置于干净小烧杯内，37℃培养24h。
观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈*，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”。 ·乙酰甲基甲醇试验(V．P试验)
标记试管 ：取装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，编号。
接种培养
以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24h。 观察记录
取出以上试管，充分振荡2min。每管分别加入40％NaOH溶液10～20滴，并加等量α-奈酚，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。 ·吲哚试验 试管标记
取装有蛋白胨水培养液的试管，编号。
接种培养
以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，空白对照管不接种，置37℃恒温箱中培养24h。 观察记录
在培养液中加入乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。
·耐盐性试验
将分离获得的细菌分别接种在NaCl浓度为2%，10%，20%，25%，的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,置37℃下培养,观察生长情况 [7]。 ·柠檬酸盐试验
取装有西蒙斯氏柠檬酸盐培养基的试管分别标记待测菌种的编号和空白对照以无菌操作分别将少量菌苔接种于各支相应的管中，然后置于37℃恒温箱中培养24h。观察结果，
6
若培养基变蓝色，则表明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源而生长，即为阳性反应，以“＋”表
示。若培养基仍为绿色则为阴性反应，以“－”表示【8】
。
6、产淀粉酶芽孢杆菌产淀粉酶活性的测定
发酵：将初筛纯菌种接种于30/250mL 种子培养基,37 ℃、250r/min摇床培养过夜。种子液以2 %接种量接种于产酶液体培养基50/500mL ,相同条件培养72h ,发酵8000r/min，离心10min ,取上清液测酶活, 每个样品重复3 次,最后结果取平均值。
在Young等方法的基础上作了改进：取5ml 0.5%的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10min，然后加适当稀释的酶液0.5ml，反应5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4终止反应。取0.5ml反应液与5ml碘液显色，在620nm处测光密度。以0.5ml水代替0.5ml反应液为空白，以不加酶液（加同样体积的缓冲液）的管为对照。酶活力根据下式计算：
酶活力（u/ml）=(R-r)/R*50*D
式中R、r分别表示对照和反应液的光密度，D为酶的稀释倍数。调整D使（R-r）/R在0.2-0.7之间。确定在40℃ 5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位。 菌种保藏法（斜面冰箱包保藏法）
将菌种接种在新鲜外面培养基上，定温培养长出丰满菌苔后（一般形成芽孢的细
菌要形成芽孢），贴上标签，放在试管上，在棉塞部位用尼龙纸或防水纸包好，以防外界污染和水浸湿，放入4℃冰箱中保藏。
热心网友
时间：2023-09-24 06:13
你可以先多分离一些芽孢杆菌，不用非要限定在土壤中，动物粪便啊，水果食品表面啊什么的都可以分离试试。然后在做淀粉分解实验，可以参考理化鉴定里面的解淀粉实验。
最后再鉴定一下是哪种芽孢杆菌。
