PCR扩增效率的评估
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发布时间：2022-10-22 01:07
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时间：2023-12-06 18:53
什么是扩增效率
PCR是一种DNA体外扩增技术，通常包括了30 - 50个循环周期。每个循环中，目标DNA分子的拷贝数最多会增加1倍。但在实际反应中，1个DNA分子在1个扩增循环后被成功复制的概率，也就是扩增效率E<1。而PCR的特点是反应初期目标DNA分子呈现指数增长，这个阶段的扩增效率可以无限接近于1；随后由于反应组分消耗或聚合酶活性下降或两者共同作用，导致反应效率逐渐下降并最终停止。不管是定量DNA分子初始量，还是计算表达量差异，都需要精确评估PCR扩增效率。
如何评估扩增效率
标准曲线是评估PCR扩增效率最可靠和稳定的一种方法，被研究者们广泛认可。该方法涉及到制作一系列的样品来控制目标模板的相对数量。这些样品通常由浓缩的原液连续稀释而成，最常用的是10倍稀释。使用一系列稀释样品，采用标准qPCR程序进行扩增获得Cq值，最后根据各样品浓度及相应的Cq值绘制标准曲线，得到线性方程Cq= -klgX0+b，扩增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR进行定量分析时，要求扩增效率范围在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。
影响扩增效率的关键因素
PCR的效率取决于许多因素，包括以下方面：
1）检测的性能。这取决于引物、模板的序列和结构。二级结构和分子间的相互作用都会降低PCR效率。
2）样品基质。其中可能含有来自样品的抑制剂和其他干扰物质，或携带来自上游加工步骤的试剂。检测样品是否有抑制作用，可使用RNA或DNA Spikes方法进行检测，或者通过倍比稀释得到标准曲线也可以观察到。
3）所用试剂及其浓度。本质上，任何PCR试剂都会一定程度上*PCR反应速率和性能。
4）竞争性反应。多重反应时，各基因的扩增存在反应成分的竞争。
5）qPCR仪器。由于仪器特定的硬件/软件属性和设置、以及用于提取Cq值的特定算法不同，相同的实验中，不同的仪器会产生不同的PCR效率。
6）技术重复。一般进行3次以上的技术重复以校正实验误差，重复数越多精确度越高。
7）连续稀释中的移液体积。移液体积越大，移液器误差或操作误差引起的影响越小。
qPCR扩增效率的判断
qPCR扩增效率主要是通过标准曲线的线性关系方程Cq=-klgX0+b来判断，扩增效率E在90%-110%之间时，认为扩增接近理想情况；参数R2要求≥0.98，R2越接近1，则说明Cq和X0的Log值之间的相关性越高。
那么扩增效率E表现不好，主要分为两种情况：
1）过低的扩增效率（<90％）
可能存在的原因：
☑ 移液器校准不良或移液技术差。
☑ 不正确的稀释导致标准曲线出现错误。
☑ 染料浓度低荧光或者仪器未校准染料。
☑ 引物设计不好或扩增子具有二级结构。
☑ 标准曲线动态范围太小。
☑ Taq酶无活性或活性降低。
☑ 样品抑制。
2）过高的扩增效率（> 110％）
可能存在的原因：
☑ 移液器校准不良或移液技术差。
☑ 不正确的稀释导致标准曲线出现错误。
☑ 引物二聚体或非特异性扩增。
☑ 标准曲线动态范围太小。
☑ 基因组DNA污染（仅限RNA模板未进行DNase I处理或DNase I消化不完全）。
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