认识核酸提取的知识笔记2020-05-07
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发布时间：2022-09-26 16:56
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时间：2023-10-02 05:37
核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。其是：裂解样品中的核酸游离在体系；纯化游离的核酸，使之与体系中的其它成分分离（如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离）。
常用的裂解液：包括去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。
去污剂的作用，是通过使蛋白质变性、破坏膜结构、解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。
盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如NaCl) 等。
裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。
二．最常用的纯化方法
（一） PC 抽提（Phenol-chloroform extraction：酚氯仿抽提）+醇沉淀：利用PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离，再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。
（二）介质纯化：利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。
（三）高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了PC操作的麻烦，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。
三．裂解方法的评价
（一）含蛋白酶的裂解方法是抽提基因组 DNA 的首选。包括裂解游离的膜蛋白与基因组 DNA 相连接的游离蛋白质。
（二）不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，在细胞基因组 DNA 抽提方面仍然有优势。尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时，控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。
（三）高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法是抽提 RNA 的首选。
（四）含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。
（五）SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。
（六）PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速。
四．纯化方法的评价
（一）PC 抽提/醇沉淀方法：稳定、可靠、经济、方便。PC 抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。
（二）高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法：同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。
（三）介质纯化方法：是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高 (虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高)。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状 (如Glassmilk、磁性小珠等)。
五．醇的沉淀
醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质（主要是盐）的分离。实际操作中，许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。最有参考价值的是 TRIzol 提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。
PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率，但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。PEG是沉淀病毒颗粒的方便手段。
六．洗涤
洗涤首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要有一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时 (使核酸沉淀最终蓬松)；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。
七．核酸质量的检测问题
目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光光度仪。
（一）电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出电泳分离范围)，电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息。
（二）紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量，该仪器的灵敏度非常高，A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 为 1.8) : 1 为理论上的数据，实际测定时会有一些差别；但如果差别太大，就有问题了。如： A260/A230 > 2 就是纯的，如果 A260/A280
> 2.3 就是核酸降解，A260/A230比2大许多，一定是有杂质残留的。
八．核酸的溶解和保存
纯化后的核酸，最后多使用水或者低浓度缓冲液溶解；其中 RNA以水为主，DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，认为 EDTA 可以减少DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险；如果操作过程控制得当，DNase 的残留几乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解DNA。
实验室常用保存方法: -20℃保存的 DNA， -70℃保存的RNA。
