直接法提取DNA的步骤?
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发布时间：2022-04-23 07:38
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时间：2022-06-17 19:48
土壤DNA???土壤有DNA??土壤微生物??一样的,用土壤浸出液,照一样的流程
一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。2 I+ P7 Y! x d/ {3 {
根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：
1、 防止和抑制DNase对DNA的降解。
2、 尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
试剂准备：
1、 TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2、 TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。" `4 {1 T( G" f+ D9 @0 ~9 g) e7 y; O
3、 裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。& Z1 H, h: o( P7 D
4、 20% SDS 6 k8 i) @+ N5 W- V$ v; y# }2 x
5、 2mg/ml蛋白酶K 2 S9 f$ `) m/ ^4 C
6、 Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿
7、 无水乙醇、75%乙醇
试验步骤：! y) e% f( A; r; j+ j
材料处理：
1、 新鲜或冰冻组织处理：/ ~$ \+ @) v2 h; a6 G% \ w' K
1) 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。. R% A. y5 z- N
2) 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。" F; k$ S4 J9 _' q+ Y2 ~
3) 加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。& ^% [8 p! u, H/ x U# `% V( I
4) 60°C水浴1-3hr。
2、 培养细胞处理：
1) 将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。0 s* r) c: v1 E
2) 离心4000g×5min，去除上清液。# p3 J. U, l. b7 v! _
3) 加10倍体积的裂解缓冲液。2 W4 L% h/ G4 P2 m6 K
4) 50-55°C水浴1-2hr。
DNA提取：
1、 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。3 ^( k# l, z. E! f5 n% H. a
2、 离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。; _4 u w2 t9 K) f; C) ]! a
3、 加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
4、 加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。# u- t0 }. d5 J" z5 y# o
5、 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。% q/ ?3 f, U8 t9 b
6、 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。
7、 待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。
8、 沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min ，弃上清液。
9、 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜
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