科普讲堂 | RNA样本提取与判读的方法及常见问题分析
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发布时间：2022-11-17 07:41
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时间：2024-03-14 08:06
核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic
Acid），存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A（腺嘌呤）、G（鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）、U（尿嘧啶），其中，U（尿嘧啶）取代了DN的T（胸腺嘧啶）。核糖核酸在体内的作用主要是引导蛋白质的合成。
RNA提取（TRlzol提取法）
1．取样，研磨（组织）： 迅速取出组织样本，在电子天平中称重约0.3-0.5 g（也可根据实际经验估测取样量），放入液氮预冷的研钵中，边研磨边加液氮，整个过程都不要使组织融化。
2．裂解：
（1）组织：按每100
mg组织加入1 mL TRIzol，继续研磨至较细粉末，将组织裂解液转移到1.5 mL 离心管中，每管约1 mL，室温放置15min以上；也可直接将研磨的较细粉末用*头刮入已取好的含有1 mL TRIzol的1.5 mL 离心管中，4℃放置10 min，或室温放置15min以上；
（2）细胞：（悬浮细胞需预处理：4℃，3000
rpm，离心10 min，收集细胞沉淀于1.5 mL 离心管底）；弃去培养液，加入适量1xPBS洗一次，弃去1xPBS，加入1 mL
TRIzol试剂（TRIzol加入量基于细胞数（1 mL/ 0.5-1x107个）或培养瓶的面积（1 mL/10 cm2），用移液器轻吹打几次，超净台中室温放置15 min以上，转移1 mL 液体到1.5 mL 离心管中。
（3）若不马上进行提取，可放入－80℃冰箱中冻存。
3．抽提： 按0.2 mL 氯仿/ 1 mL TRIzol的比例加入氯仿，vortex 30 sec或用手剧烈摇动15 sec，室温放置2-3 min后， 4℃，12000 rpm，离心15 min；小心转移上清到一新的1.5 mL 离心管中，不要吸取中间层。
4．沉淀： 按异丙醇/上清=1:1的比例加入异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置30 min后，4℃，12000 rpm 离心15 min。弃上清，异丙醇不要回流过多，可再短暂离心，用移液器将剩余的异丙醇吸出。
5．漂洗： 加入1 mL 75％乙醇，用手指将沉淀块弹起，上下颠倒几次，4℃，12000 rpm 离心5 min。弃上清，75％乙醇不要回流过多，可再短暂离心，用移液器将剩余的75％乙醇吸出。
6. 风干，溶解： 超净台中自然干燥 5-10 min，不要真空离心干燥， RNA不要完全干透，以防不能完全溶解；用DEPC水溶解RNA，60-65℃助溶 5-10 min。
7. 定量： 进行Total RNA定量，如果不马上定量，将样品贮存于-80℃。
RNA定量
我们一般通过Nanodrop紫外分光光度计测定RNA样本在260nm处的吸光值来计算RNA含量。但是，DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，其性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。所以紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。
Nanodrop紫外分光光度计可以得到以下参数：
OD230 ：杂质（酚、糖原等碳水化合物）的吸光度；
OD260 ：核酸的吸光度；
OD280 ：蛋白质的吸光度；
OD260 /280 ：纯的RNA比值在1.5 ~2.1之间，如果比值低，表示受到蛋白质的污染；
OD260 /230 ：纯的RNA比值在2.0 ~2.5之间，如果比值低，表示受到有机物如糖、肽、苯酚等的污染。
RNA完整性鉴定
我们一般使用电泳、Agilent2100等仪器来鉴定RNA的完整
RIN值
RIN（RNA integrity number）代表RNA完整性的数值，对total RNA的完整性进行数字化的评估，范围在1 ~10，数值越接近10表明样品完整性越高，反之完整性越差，如下图所示。
RNA降解程度对各个测序项目的影响
① 转录组测序： 降解程度会影响5’ 端的数据质量；
② micRNA测序： 由于本身的片段较小，受降解的影响较小；
③ 降解组测序： 若受到外源降解，回复给内源性降解，受影响较大；
④ lncRNA和circRNA测序： rRNA去除方式建库，样本降解影响小。
原核污染对各个测序项目的影响
① 转录组测序： 一般不影响数据，轻微污染时可无视，污染较严重时需增加建库起始量；
②micRNA测序： 对数据影响较小，一般是按污染比例对数据的比对率和有效数据量产生影响，轻微污染时可无视，污染比例较高时需加测数据量；
③ 降解组： 情况同转录组；
④ lncRNA和circRNA测序： 影响极大，建库方式决定了如果污染，若不给予处理，数据可能完全没法用，故对该问题需要高度警戒。
常见问题分析
得率低：
① 样品裂解或匀浆处理不彻底；
② RNA沉淀未完全溶解。
A260/A280<1.65（RIN<7）：
①检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高；
②样品匀浆时加的试剂量太少；
③ 匀浆样品时未在室温放置5分钟；
④ 吸取水相时混入了有机相；
⑤ RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：
①组织取出后没有马上处理或冷冻；
②待提取RNA的样品保存在了-5至-20℃；
③细胞在用胰酶处理时过度；
④溶液或离心管未经RNase去除处理；
⑤电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。
DNA污染：
①样品匀浆时加的试剂量太少；
②样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液蛋白聚糖和多糖污染：沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1mlTRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心，按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。
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