PCR产物的酶切问题

结果不确定，第一种可能性是：你PCR反应的温度（退火温度）和时间（延伸时间）没有掌握好。因为PCR反应的特异性决定于退火温度的高低，退火温度越低，应物越容易发生错配，这样的话也会有杂带。第二种可能是酶切不完全，也就是你酶切时间不够，不过你说酶切过夜了，这种可能性不会很大。还有一种可...

1. 首先确认PCR产物，取一小部分PCR产物跑胶。2. 如果产物良好，一个特异性很强的条带，则用过柱的方法提纯（就是你平时用的从溶液中纯化DNA的试剂盒就可以）。楼上说的跑胶后再提，早就过时了。效率很低。3，提纯加入限制性内切酶缓冲液，酶。按照平时的方法反应就可以了。4. 酶切后再过柱提...

PCR-RFLP技术我曾经做过，说实话这并不是一个稳定有效的鉴定方法，当时我也遇到和你一样的问题。有这样的情况，一种是你选择酶的时候选择错误，在你该段基因上根本不存在这个酶切位点。二是你根据别人发表序列确定了存在该酶切位点，但是因为基因突变等情况，导致你的病例酶切位点发生变化。三是即使...

MspI酶，或者说任何DNA限制酶都有一个最适合的底物浓度去反应，我估计你的PCR产物浓度很大，你不妨考虑一下这一点。至于你说的酶切产物变大的这个问题，个人认为你用1%的胶去跑290bp的条带是测不准的。其二，3%跑出来显示310bp也不一定是这个大小，极有可能是你根本就没有切开。你不妨把你酶切的...

1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。双酶切时间...

首先，回收PCR产物时，选择合适的限制酶至关重要。推荐使用BamHI和HindIII等高效粘端酶，同时注意查看各公司使用的公用BUFFER和酶在其中的效率。在引物两端设计酶切位点，并添加保护碱基以防止酶切损伤。在酶切过程中，一般3小时的酶切时间足够，无需过夜。使用大体系，如100微升，可以提高效率。对于纯化...

如果PCR产物需要酶切，就需要加上保护碱基。不同酶切位点所需要的保护碱基是不一样的，一般参考NEB网站上的一个保护碱基表。一搜就有了。如果不做PCR产物酶切而是直接连接T载体，就可以不加保护碱基，PCR结束后直接加A连T,然后按流程操作就可以了。一般是需要转化-验证-测序，如果是构建表达载体的话...

与其浪费内切酶和时间，何必呢，你还不如纯化后酶切，只不过多了个步骤而已。至于PCR产物的保存，没有什么特殊要求，反应结束后你可以直接冻在－20。也可以跑电泳后切下你的目的条带放在四度，如果是纯化了保存，如果你不反复冻融的话，放几年没有问题。DNA是很稳定的 ...

这种方法是采用虾碱酶（SAP，Shrimp Alkaline Phosphatase）和外切酶I的混合溶液，来消化pcr扩增体系中多余的dNTPs和引物，以便后面的测序。一般使用的终浓度为1ul混合溶液中，含有虾碱酶0.6单位，外切酶I1.2个单位，这个比例也可以自己通过试验来调整。一般是1ulpcr产物加2ul溶液。37度孵育15分钟，即可...

PCR完了以后不能直接加酶切体系去做酶切。整个体系的离子浓度都不对的。这么切不切碎才怪。老老实实的PCR跑胶回收，或者PCR过柱回收再作酶切。变暗是因为体系不对都被切碎了星号反应。另外PCR体系请扩大一下，25ul做克隆太少了。至少50ul。