冰冻切片的制作步骤及每个步骤的要求和作用?

发布网友发布时间：2022-04-22 22:37

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热心网友时间：2023-10-06 04:50

冷冻切片 1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（1~3分种）。 2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5~10μm间。 4、调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，以切出完整、平滑的切片为准。切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带，可避免组织摊片过程中皱折，保证组织结构的完整及切片的美观。注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织，普通胶水或 OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。（OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。） ②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻，约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上，组织周围再加一些胶，再次置于冷冻机中冷冻，这样组织被垫高，就能快速切出高质量的切片。 ③冷冻箱及冷冻头的温度高低，要根据不同的组织而定。温度过低会导致组织块过硬，切片碎裂，出现梯田状薄厚不均或空洞；反之，温度过高，组织块硬度不够，切片不易成形或成皱褶。数据图1供参考。 ④当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。 ⑤用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。四、常用冰冻切片苏木精—伊红染色染色步骤：1、冰冻切片用10%甲醛固定1~5分钟，流水冲洗2分钟，蒸馏水浸洗3分钟。 2、苏木精1~2分钟。自来水快洗。 3、0。5%盐酸乙醇分色1~2秒。蒸馏水快洗。 4、0。25%~0。5%氨水蓝化，几秒种或至组织变蓝，自来水洗30秒~1分钟。光镜下检查细胞核分色程度。 5、1%伊红1分钟。蒸馏水快洗。 6、80%、90%、95%乙醇速洗，每级数秒到十几秒。光镜下监控细胞核与细胞质量颜色对比。 7、100%乙醇2次，每次1~2分钟。 8、二甲苯2次，每次1~2分钟。中性树胶封固。注：①结束阶段的二甲苯作用为透明，其目的是增强标本的折光率，达到光镜下清晰观察染色结果。标本内若含水分可降低其折光率，导致光镜观察细微结构不清楚的结果。另二甲苯透明后有得于组织细胞的长久保存。 ②HE染色的水洗：整个染色过程*5处涉及到水洗，但其洗涤程度及作用均有所不同。苏木精染色前的水洗为蒸馏水浸洗：切忌自来水替代蒸馏水浸洗，否则苏木精染液由弱酸性（棕红色）转变为弱碱性（蓝色），导致“有色沉淀”出现与积累，致使染色结果为黑蓝色。苏木精染色后的水洗为自来水洗，伊红染色后的水洗为蒸馏水快洗，作用是洗去未与组织相结合的染料成分，即洗去“浮色”。伊红染液为水溶性溶液，浸洗时间长会使组织的伊红颜色减退。分色后的水洗为自来水快洗，目的是终止分色液（0。5%盐酸乙醇）对组织细胞的分色作用。过度分色将致使染色强度减弱，影响苏木精与伊红颜色的匹配。蓝化后的水洗为自来水冲洗，洗掉组织中多余的碱性成分（淡氨水），为伊红染色提供适宜的染色环境。五、冰冻切片的快速染色法 ① 切片固定30秒-1分钟。 ② 水洗（10秒）。 ③ 染苏木素3-5分钟。自来水冲洗片刻。（在组织上加苏木精染液数滴，放在漂片机上的烤板上加热一分钟。染液不能干） ④分化（1%酸乙醇分化）。 ⑤ 于碱水（氨水）中返蓝20秒。 ⑥ 伊红染色10-20秒。 ⑦脱水，透明，中性树胶封固。注：固定液的选择 A中性*溶液 B 95%乙醇 C AF(40%*10ml,95%乙醇90ml) D Carnoy（纯乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml） E Clzrke改良液[4]（纯乙醇95ml，冰醋酸5ml） F Bouin液（饱和苦味酸水溶液75ml，甲醛水溶液 25ml，冰醋酸5ml） 6种固定液固定后的组织切片染色效果各有差异，其中C 固定液固定的切片染色效果最好，组织结构清晰，核染色鲜艳，核无明显肿胀，核浆对比度好，镜下与石蜡切片相似（图1）。 D 液、E 液、F 液染色效果均较好，结构较清晰，核染色较鲜艳，但核有肿胀，核轮廓有些模糊。A 液染色效果较差，组织结构尚清楚，但细胞核肿胀比较明显且境界模糊不清（图2）。B 液染色效果差，核着色不良，结构模糊。甲醛、乙醇、冰醋酸

热心网友时间：2023-10-06 04:50

一、固定：
固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀，停止发生死后组织变化，尽量保持其活体状态的过程。
固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本实验用的是注射、关注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难流入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，就可采用灌注或灌流固定法。固定时将固定液直接注入动物的血管，经血管分支到达整个组织或全身，从二十只得到充分固定。
固定液分为单纯固定液和混合固定液。单纯固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。本实验用的固定液为4%甲醛（10%*）。
固定后的处理：用水配制的固定液固定后应用流水冲洗，可是组织中的固定液随时溢出和随时洗去。对小动物和脑组织等，应以浸泡为主，即能达到冲洗的目的，又不损害组织。
【注意事项】
1.固定要及时。
2.组织块的大小要合适。
3.应有足够的固定液，一般与组织块的比例为20:1，容器勿过小，组织勿过多。
4.固定时间要合适，甲醛固定液一般固定两天左右，第一天要更换一次固定液。
5.要进行促使固定，在固定期间轻轻地搅动组织或摇动容器使组织移动有利于固定液的渗透，适当提高温度也可缩短固定时间。
6.选择合适的固定液。
7.一次取材数量过多时，应对取材部位和顺序进行编号，并及时做好记录。
二、脱水
脱水就是用某些溶剂逐步将组织块内的水分置换出来的过程，使用的试剂称为脱水剂。脱水剂有非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇、丙酮等，和脱水兼石蜡的脱水剂如正丁醇等。
本实验所用的是乙醇脱水。乙醇是最常用的脱水剂，其优点是脱水能力强，即能与水相混合，又能与透明剂相混，并可使组织硬化，便于切片。缺点是穿透组织的速度快，且容易使组织收缩、变脆。为克服这一缺点，在一般脱水中，应采用循序渐进的方法，逐步升级，经一系列不同浓度的乙醇，使组织中的水分逐渐被乙醇代替。
脱水时间视组织块大小、性质和类型而定。
【注意事项】
1.脱水必须彻底，组织块只有脱水充分才能在透明剂中有良好的透明，也有利于染色。脱水须在有盖子的瓶中进行，高浓度乙醇易吸收空气中的水分。
2.脱水剂的用量不能太少，应为组织块的5~10倍以上，并及时更换。
三、透明
在切片制作过程中有两次透明，第一次是脱水以后组织块的透明，第二次是染色以后切片的透明。二甲苯是最常用的透明剂。它是一种无色透明的液体，容易挥发，透其明能力强，但易使组织收缩变脆，所以组织块在二甲苯中不宜久留。
【注意事项】
1.透明剂的用量不能太少，应为组织块的5~10倍以上。
2.透明过程中用的器材如镊子必须干燥，不得将水滴入二甲苯中。
3.二甲苯是一种易挥发的有毒气体，长期接触对呼吸道粘膜等有刺激作用，所以在使用时应在盛二甲苯的容器上加盖盖子。
四、组织切片（冰冻切片法）
操作程序：
1.切片前先安装好刀片，调整好切片厚度及切片角度。根据标本的组织类型，确定最佳切片温度。
2.将待切的组织块平放在软塑瓶盖或特质小盆内，直接或涂敷包埋剂后马上放到冷冻台上冷冻。
3.将冻好的组织块安装到组织块夹持器上，调整好刀片与组织块之间的角度和距离，调整好防卷板的位置和角度。
4.准备好后，转动切片机旋转轮的手柄进行切片。将切好的切片黏附在载玻片上，室温下自然晾干1-2小时后可根据不同的需要进行固定、染色等制片步骤，也可用锡纸包好后封存于-20C摄氏度冰箱中待用。
【注意事项】
1.切片时恒冷箱内的适宜温度是-20—-15摄氏度。
2.为防止组织中形成冰晶而影响细胞的形态，甚至破坏细胞的结构，在组织冰冻时要采用速冻的方法。
3.组织块在冰冻时，应根据组织的形状和结构来放，切片也是如此。
4.切片时，若发现冰冻过度，可将冰冻组织块取出在室温下放置片刻再切片。
五、染色（HE染色）
（一）染色试剂配制
1.苏木精染液苏木精染液是常用的一种燃料，主要用于对细胞核的染色。苏木精本身与组织的亲和力很弱，HE染色实际是通过苏木精的氧化物—苏木红对组织细胞进行染色。苏木精可通过自然和化学方法两种方式氧化成苏木红。自然方法是将苏木精溶液爆率在阳光下或空气中。化学方法是将化学氧化剂加入苏木精溶液。
Harris苏木精配方：A液（苏木精1g，无水乙醇10ml），B液（钾明矾20g，蒸馏水200ml），氧化汞0.5g，冰醋酸8ml。
配制方法：想将A液搅拌溶解，再将B液煮沸融化去火。将A液缓缓加入B液，混合后煮沸约1分钟。离火后在该混合液中加入氯化汞，用玻璃棒充分搅拌至染液变为紫红色，冷却后加入冰醋酸混匀，过滤后即可使用。
2. 伊红染液伊红是一种煤焦油染料，是细胞质较为想的染色剂。常用的是1%伊红醇溶液。其配方是在95%乙醇100ml中加入1g伊红，玻璃棒搅拌均匀。
3. 1%盐酸酒精分化液 36%-38%的盐酸1ml加入75%乙醇99ml中混匀即可。
（二）染色过程
1．切片进入苏木精染液5-30min（根据不同需要和颜*况决定染色时间）。
2．自来水洗去浮色。
3．1%盐酸酒精分化数秒。
4．自来水冲洗半小时以上，是切片蓝化。
5．蒸馏水洗。
6．如伊红染液复染1-10分钟，使细胞质染成红色。
7．按顺序经95%乙醇ǀ、ǁ中脱水兼分化伊红颜色各1min。
8．入无水乙醇中彻底脱水4-5min（ǀ、ǁ各两分钟左右）。
9．1/2二甲苯（无水乙醇：二甲苯=1:1）1min。
10.二甲苯ǀ、ǁ透明，每次各约2-3min。
11.封固切片
（三）染色结果
细胞核被苏木精染成鲜艳的蓝色，细胞质、结缔组织和嗜酸性颗粒等被伊红染成不同程度的红色，红蓝相应色彩鲜明，对比明显。
【注意事项】
1.掌握好染色时间和分化时间。
2.自来水冲洗过程中应注意不要用水直接冲自组织。
3.切片染色后用乙醇脱水应从低浓度到高浓度进行。

热心网友时间：2023-10-06 04:51

运用冰冻切片法制片的步骤和要求是:第一步取材与固定。新鲜的组织块可不经过固定处理直接进行冰冻后切片。为了切出薄片,一般多采用 10%*液固定。第二步切片。首先要安装好切片机,将标本台用水湿润到适宜程度后,将组织块放在上面, 并使组织块冻结,同时调好切片的厚度和转动标本台的升降把手,使冰冻的组织块上端与切片刀口相接为止

热心网友时间：2023-10-06 04:51

冰冻切片是在低温条件下组织快速冷冻到一定的硬度，然后用特殊的冰冻切片机切片的一种方法。冰冻切片制作并不复杂

热心网友时间：2023-10-06 04:52

1.切片前先安装好刀片,调整好切片厚度及切片角度。根据标本的组织类型,确定最佳切片温度。
2.将待切的组织块平放在软塑瓶盖或特质小盆内,直接或涂敷包埋剂后马上放到冷冻台上冷冻。
3.将冻好的组织块安装到组织块夹持器上,调整好刀片与组织块之间的角度和距离,调整好防卷板的...
4.准备好后,转动切片机旋转轮的手柄进行切片。