叶绿素皂化反应的步骤
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发布时间：2023-02-18 04:21
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时间：2023-09-21 20:09
（二）实验原理
（三）实验步骤
（四）实验报告
一、实验目的和意义
测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用
绿色植物的光合作用是在叶绿体中的叶绿体色素中进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用的本质很有帮助。
二、叶绿体在细胞中运动（略）
三、叶绿体在细胞中的分布与结构（略）
四、类囊体膜的结构及功能 （略）
五、实验原理
1、植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。它一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
2、叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
3、色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
4、叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
5、叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
六、实验步骤(1)
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度D，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
Ca=12.7D663 –2.69 D645（3）
Cb=22.9 D645 –4.68D663（4）
Ck=4.7D440- 0.27Ca+b
根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：
D＝KCL
D：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度, K：为比吸收系数（吸光系数）， L：液层厚度，通常为1cm.
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
实验材料和器材
器材：721型分光光度计、电子天平、量筒、研钵、剪刀、漏斗、滤纸、移液管（1mL）、试管及试管架、洗耳球、酒精灯等。
试剂：丙酮、80%丙酮、醋酸酮、5%盐酸、碳酸钙、石英砂等
七、实验步骤(2)
分离：在大试管中加入推动剂，然后将滤纸固定于胶塞的小钩上，插入试管中，使尖端浸入溶剂内（色点要高于叶面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），盖紧胶塞，直立于阴暗处层析。
当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，观察色带的分布。叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为*，胡萝卜素为橙*。用铅笔标出各种色素的位置和名称。
1.叶绿体色素的提取
（1）取植物新鲜叶片1克，洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放人研钵中。
（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，2-3 mL95%乙醇，研磨至糊状，再加2-3 mL95％乙醇，过滤，即得色素提取液。
2.叶绿体色素的分离
点样：取前端剪成三角形的滤纸条，用毛细管取叶绿素提取液，如图点样于“色点”处，注意每次所点溶液不可过多，点样后晾干，再重复操作数次。
八、理化性质测定
1、氢和铜对叶绿素分子中镁的取代作用
方法一；取两支试管。第一支试管加叶绿体色素提取液2mL，作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液2 mL，再加入稀盐酸1滴，摇匀，观察溶液颜色变化。当溶液变竭后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记录溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。
将上一个实验中提取的叶绿体色素溶液适当稀释后，进行以下实验：
1.荧光现象的观察。
取l支试管加入浓的叶绿体色素提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同，可观察到反射出暗红色的荧光。
2.氢和铜对叶绿素分子中镁的取代作用
3. 叶绿体色素吸收光谱曲线
将上述叶绿体色素提取液注入1cm比色杯中，另取95%乙醇作空白，于400-700nm之间，每间隔10nm读取光密度值。根据测定结果，以波长为横坐标绘制曲线，此即叶绿体色素的吸收光谱曲线。用同样的方法测定皂化作用中分离出绿色素与*素的吸收光谱曲线，并对结果进行分析。
4、皂化作用（绿色素与*素的分离）
取叶绿体色素提取液2 mL于大试管中，加入4mL乙醚，摇匀，再沿试管壁慢慢加人3～6mL蒸馏水，轻轻混匀，静置片刻，溶液即分为两层，色素已全部转入上层乙醚中。用滴管吸取上层绿色层溶液，放入另一试管中，再用蒸馏水冲洗一、二次。在色素乙醚溶液中加入30％KOH－甲醇溶液，充分摇匀，再加入蒸馏水约3 mL，摇匀静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是水溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b，上层是乙醚溶液，其中溶有*的胡萝卜素和叶黄素。将上下层放入两试管中，可供观察吸收光谱用。
九、含量测定
（1）取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎，混匀。
（2）称取剪碎的新鲜样品0.5g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3mL80％丙酮，研成匀浆，再加80％丙酮5mL，继续研磨至组织变白。
(3）转移到25mL棕色容量瓶中，用少量80％丙酮冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入容量瓶中。最后用80％丙酮定容至25mL，摇匀。离心或过滤。
(4）将上述色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以80％丙酮为空白，在波长663nm、645nm、652nm和440nm下测定光密度。
十、实验结果计算
将测得的光密度值代入公式，分别计算叶绿素a、b、a+b和类胡萝卜素的浓度（mg／L）。
并按下式计算组织中单位鲜重或干重的各色素的含量：
色素浓度（mg／L）×提取液总体积×稀释倍数
色素在叶片中的含量（%）= ×100% 样品重量（mg）×1000
稀释倍数：若提取液未经稀释，则取1
十一、实验中的疑惑
1.试述叶绿体色素的吸收光谱特点及生理意义。
2.在皂化反应中加入乙醚有什么作用？
