酵母的转化和克隆
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发布时间：2023-02-21 10:20
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时间：2023-10-04 22:44
酿酒酵母作为一种普遍用于遗传学和细胞生物学研究的简单真核模式生物，能有助于深入了解人类细胞进程。
这里主要记录：酵母细胞摄取外源DNA
穿梭载体：是指能在多个不同宿主种属中内复制的载体，如既可在大肠杆菌中又可以在酵母中复制的载体。
酵母载体可以是非整合型也可以是整合型载体。质粒既可以整合到基因组DNA中，也可以独立存在。
通常用于酵母的质粒或载体有以下5种，最常用于转化酵母细胞的是酵母游离质粒YEp 和 酵母着丝粒质粒 YCp。
这两个质粒都含有自发复制序列ARS，自发复制序列含有复制原点，使之能在酵母体内独立于染色体进行复制。
醋酸锂法利用带有正电荷的锂离子中和细胞壁和质粒上的负电荷，转化混合物中的单链DNA将结合在细胞壁上，因而只剩质粒DNA能被酵母细胞摄取。
然后利用突然增温，造成细胞内外压力差，在细胞壁上形成小孔让质粒进入。一旦温度降下来，酵母细胞壁恢复，转化即可完成。
先从琼脂平板挑取酵母细胞，然后用酵母膏-蛋白胨-葡萄糖培养基（YPD），一种酵母生长的完全培养基来扩增克隆。30摄氏度摇床或旋转器培养过夜。
离心酵母细胞，弃上清留沉淀，然后用相应的缓冲液或蒸馏水重悬。这样准备的感受态细胞将被用于转化。
按照下图配比配制“转化mix”，试剂配制好后，置于30摄氏度摇床30min（混匀即可，不必大幅度震荡，以免酵母细胞破裂）
细胞置于42摄氏度水浴热激15min，然后置于冰上冷却2min，离心收集细胞。细胞用双蒸水重悬后涂板在含有载体相应抗性的选择性培养基上。转化后的平板在30摄氏度继续培养2-4天，直到长出克隆。
应用目的：鉴定与诱饵蛋白相互作用的蛋白。
将来自候选结合蛋白文库的质粒转化酵母细胞，如果它编码的蛋白与诱饵蛋白有相互作用，就会释放转录因子，从而激活报告基因，如β-半乳糖甘酶。在含有β-半乳糖甘酶底物的平板上，报告基因会使含结合蛋白的阳性克隆变成蓝色。
利用性循环的技术手段在酵母中制造多点缺失。含报告基因和缺失位点的单倍体细胞通过随机分配和减数*重组的方式，整合成一个细胞。
可以通过选择标记，筛选含有缺失的酵母细胞。
酵母的转化和克隆
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