我们有一个质粒，他含有终止密码子，教授要我对其设计引物然后做PCR，并对PCR产物进行双酶切，但我不知道

发布网友发布时间：2022-04-29 21:02

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热心网友时间：2023-10-09 03:52

在你PCR引物上正向和反向序列前各添加一个酶切位点（既然是双酶切那这两个酶应该不一样，同时注意移码的问题，且这两个酶切位点是你要用的载体上也存在的，而已扩增的目的片段里没有）。pcr后连T载体再酶切回收。同时用同样的酶对你的载体酶切并回收，再将两者相连。
你说到的去除终止密码子，应该是指的你的目的片段上的，你可以在设计引物的时候将基因的最后三个碱基去掉直接加酶切位点就可以将其去除了追问恩，那个终止密码子是在目的片段上。对了，我要做PCR的那个质粒和我要用的载体是同一个质粒，所以扩增出来的目的片段上含有那两个酶切位点啊，这样才能对其进行双酶切啊，所以不太理解那句“而已扩增的目的片段里没有”是什么意思。谢谢！

追答“目的片段没有”因为你的PCR产物要经过酶切连接到载体上，在之前肯定要用酶切过才能连到在体上边去，如果你的PCR产物里边除了你另外添加到两端的酶切位点外，还在PCR产物中间某个位置有这两个酶切位点中的一个，那么你酶切的时候就会将其切断，从而无法将完整的片段连接到载体上边去

热心网友时间：2023-10-09 03:52

这个你要问问你的教授是想干什么用。PCR扩增的是片段，要看让你设计什么样子的引物，引物包含双酶切位点，终止密码子一般是不能切掉的，切掉了这个基因就会一直转录下去，合成的蛋白就不是以前的蛋白了。追问恩，我们含有两个终止密码子，所以要去掉一个。我刚才问了，跟我的想法是一样的！谢谢你的回答！