qpcr原理及应用是什么?
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发布时间:2022-04-29 03:31
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时间:2022-07-10 20:25
一、原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。
在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:
1、 模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
2、 模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
3、 引物的延伸:DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链;
重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
二、应用
1、基因表达分析:例如结核分岔杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是一种生长相当缓慢的细菌,传统培养及鉴定一般需要花数周时间。
2015年时Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己发展的real time PCR检测mpt64,直接检测病人痰液中的结核分岔杆菌,分析715个检体657个病人,其检测灵敏度(sensitivity)及特异性(specificity)分别为90.3%及98.6%。
整个实验流程可以在5个小时内完成,此方法可以用于没有套装试剂(kit)可以使用的实验室。
2、检验生物芯片的结果;
3、siRNA与miRNA诊断;
4、基因型鉴定;
5、饮食分析;
6、兽医微生物检测。
特点
1、荧光实时定量PCR的基本原理有两个要点:首先是对PCR反应中的每一个循环的反应产物进行实时检测并记录下来;
其次,用于检测PCR产物实时检测的荧光染料标记在一段可以与单链PCR产物(模板)特异性杂交的探针上,并且处于淬灭状态,只有当探针与模板特异性结合以后才有可能释放出荧光信号。
2、每一轮循环中PCR的产出量都以荧光信号的形式被PCR仪的光学检测系统记录下来,在某一循环中荧光信号的强度达到预先设定的阈值时,此时的循环数称为CT(Threshold Cycle),Ct值与起始的模板量成反比,起始的核酸量越多,达到阈值的循环数就越少,换句话说CT值会越小。
如果要确定量的话,需要做出标准曲线,以Ct值为纵坐标,起始模板数为横坐标作图。在新的MIQE规范中Ct这个惯用的名词被重新定义为Cq值(quantification cycle)。
qpcr原理及应用
qpcr原理及应用如下:1、qpcr原理:qPCR,即荧光定量PCR,其原理主要包括定量分析的数学原理和产生荧光的化学原理。在DNA扩增反应中,qPCR通过荧光化学物质测量每次聚合酶链式反应(PCR)循环后的产物总量。在扩增的每个循环中,模板DNA经历变性、复性、延伸三个阶段,形成更多的子代DNA,为下一个循环提供模板。
GPCR抑制剂
G蛋白偶联受体(GPCR)是一类广泛存在于人体细胞膜上的受体蛋白,包括许多亚型如α、β和γ等。其基本结构包括一个七次跨膜结构域和一个胞浆C-末端。GPCR定位于细胞膜上,作为信号传递的关键组件,参与多种生物过程,如细胞信号转导、细胞极化和...
qpcr原理及应用是什么?
qpcr原理及应用是:qPCR原理是将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系中,在特定光激发下发出荧光。随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检...
qpcr原理及应用
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qpcr原理
QPCR,全称为Quantitative Polymerase Chain Reaction,其核心原理是利用荧光标记的Taqman探针在循环反应中对特定DNA片段进行扩增并实时监测。在每个循环中,探针与模板DNA配对并断裂,释放出的荧光素在特定激发下发出荧光。随着扩增次数增加,荧光信号强度呈指数增长,通过测量荧光强度的变化(Ct值),可以推算出...
qpcr原理及应用
qpcr原理是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快,成为分子生物学诊断的主流。应用行业:各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医...
qpcr的基本实验原理?
qPCR基因表达分析技术,可以定量检测DNA或RNA样品中特定基因的拷贝数目。它基于聚合酶链反应PCR的原理,增加了实时荧光检测系统。qPCR的基本实验原理如下:样品处理:首先,需要从待检测的组织或细胞中提取目标DNA或RNA,并进行适当的纯化和浓缩处理,以确保获得高质量的核酸模板。反转录(如果检测的是RNA):...
qpcr原理及应用是什么?
qPCR/实时 PCR 仪器 实时 PCR 检测系统由配备光学检测模块的热循环仪组成,用于测量每个扩增循环期间荧光团与目标序列结合时产生的荧光信号。Bio-Rad 实时 PCR 检测系统具有热循环仪和可互换的模块,用于荧光团的单重和多重检测以及固定的实时 PCR 单元。所有 qPCR 系统都具有热梯度功能。
qpcr技术原理及应用是什么?
qpcr原理及应用如下:原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。RT- PCR(Reverse ...
qpcr原理及应用
qPCR原理及应用 一、原理 实时荧光定量聚合酶链反应是一种分子生物学技术,它结合了DNA扩增与荧光检测技术。通过实时监测PCR过程中荧光信号的变化,实现对特定DNA序列的定量分析。其基本原理是,在PCR反应体系中加入荧光染料或特异性探针,随着反应的进行,扩增的DNA片段与染料或探针结合产生荧光信号,这些信号...
qpcr原理及应用是什么?
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