求细胞凋亡的一些系统的检测方法,最好全!谢了!
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发布时间：2022-04-29 01:46
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时间：2022-06-27 22:09
产品说明：
凋亡是一种程序性的细胞死亡，与细胞的坏死有生化和形态等方面的不同。磷酯酰 丝氨酸(phosphatidylserine, PS)是细胞膜的一种组成成分，在正常细胞主要分布在细胞膜内侧；细胞发生凋亡的早期，PS会外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。Annexin V 对PS有高度的亲和力，可以选择性结合和标记PS 。本试剂盒采用重组人Annexin V-EGFP融合蛋白，来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的PS，标识出凋亡细胞。由于坏死细胞和凋亡晚期细胞，其膜内侧的PS也可以被Annexin V结合，通常用另一种活细胞非透过性荧光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)进行双重染色，以区别凋亡早期细胞与坏死细胞和凋亡晚期的细胞。用Annexin V-EGFP和PI染色后，正常的活细胞不被Annexin V-EGFP和PI着色；凋亡早期的细胞仅被Annexin V-EGFP着色，PI 染色呈阴性；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-EGFP和PI着色。用流式细胞仪或荧光显微镜直接观察PS外翻这一细胞凋亡的重要特征，是一种快速简便的细胞凋亡经典检方法。
操作方法：
染色液的配制：
1) 取适量4x Annexin V结合液，用双蒸水稀释至1xAnnexin V结合液。后续工作均使用1x Annexin V结合液。
2) 将20 μl Annexin V-EGFP加入1 ml Annexin V结合缓冲液中，即配成10次测试的 Annexin V染色液。
3) 将5 μl PI加入5 ml Annexin V结合缓冲液中，即配成10次测试的PI染色液。
荧光显微照相操作方法：
1) 培养细胞用所需方法处理以诱导凋亡。应同时设置阴性对照。
2) 对贴壁生长细胞，离心收取培养液内的悬浮细胞，并用胰酶消化贴壁细胞，合并两部分细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用冰冷PBS洗涤细胞后， 1000g离心5 min，弃上清，加入100 μl Annexin V染色液轻轻重悬细胞。室温(20-25℃)放置，孵育10~15 min。再加入PI染色液0.5 ml混匀。室温孵育5 min
3) 完成孵育后，1000g离心5 min，弃上清，轻轻重悬细胞于50~100μl Annexin V结合缓冲液中；取25-50μl细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。
4) 荧光显微镜下，用蓝光激发，观察和拍摄细胞红色发射图像。结合Annexin V-EGFP 的凋亡细胞的质膜将显示绿色光圈；膜结构不完整的坏死细胞和晚期凋亡细胞在整个核区被PI染成红色而质膜为Annexin V-EGFP阳性呈现为绿色光圈。
5) 培养于48孔板或96孔板内的贴壁细胞，也可进行原位染色。在凋亡诱导结束后，用冰冷PBS轻轻洗涤细胞，完全去除PBS，加入100 μl Annexin V染色液，室温孵育 10~15 min；吸除染色液，加入PI染色液0.5 ml混匀。室温孵育5 min。立即在倒置荧光显微镜下观察。
流式细胞分析操作方法：
1) 培养细胞用所需方法处理以诱导凋亡。应同时设置阴性对照。
2) 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用冰冷PBS洗涤细胞后，取5~10万重悬的细胞，1000g离心5 min，弃上清，加入100 μl Annexin V染色液轻轻重悬细胞。室温(20-25℃)放置，孵育10~15 min。
3) 再加入PI染色液0.5 ml混匀。室温孵育5 min。
4) 完成孵育后，立即进行流式细胞分析。采用488 nm双波长激发，测定~510 nm和>575 nm的发射，细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包括极晚期凋亡细胞）有绿色和红色荧光双重染色。
注意事项：
1) 该试剂盒只能检测活细胞，而不能用于切片、擦刮、固定或浸润细胞样品的检 测。如需对活细胞固定进行其它检测，可在本试剂盒标记完成后，用Annexin V结合缓冲液清洗细胞，再固定进行后续操作。
2) 细胞凋亡是一种持续变化的动态过程，选择合适的诱导时间对观察凋亡比较重要。
3) Annexin V和PI染色的活细胞应尽快检测。
4) 微生物污染的细胞样品或试剂可导致错误的观察结果。
参考资料：网上资源
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时间：2022-06-27 22:10
1.形态观察，用DAPI染色，具体自己看书
2.TUNNEL法。因为凋亡细胞DNA会被切断，所以会出现3’末端，这种方法就是标记3’末端。具体自己翻阅资料
3.彗星电泳法，用单个细胞破碎然后电泳，其DNA条带呈彗星状。
4.DNA电泳梯度条带法就不用说了吧，这个最经典
5.流式细胞仪法。因为能够检测DNA含量。
具体想了解的话还是自己去看书吧。
热心网友
时间：2022-06-27 22:10
细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。
根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜
（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割
成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
3 透射电子显微镜观察
结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
图2
图不好弄过来 你就去下面看看
http://www.ibioo.com/experiment/celltech/apoptosis/2008/4331.html
参考资料：http://www.ibioo.com/experiment/celltech/apoptosis/2008/4331.html
热心网友
时间：2022-06-27 22:11
物理方法基本上是流式细胞仪之类的仪器
化学方法基本上就是染色了观察
生物学方法就是用荧光免疫之类的
几句话也说不清楚
感兴趣的话可以看翟中和的《细胞生物学》，细胞衰老和死亡这一章
