如何提高DNA片段的转化率
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发布时间：2022-05-14 04:02
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时间：2024-02-23 17:54
克隆分析用于将DN*段从一个载体（质粒、黏粒或噬菌体）转移到另一个载体上。它们通常用于构建表达系统，或是将DN*段转移到特殊的载体上以制备杂交探针或是制备测序用的单链模板。典型的载体含有三个必要的元件：一个抗生素抗性标记、一个复制起点（以便选择转化了的大肠杆菌宿主）以及一个或多个可供插入外源DN*段的*酶切位点。
基本的亚克隆操作包含四步：首先用合适的*性内切酶切割载体与插入片段，接着用T4DNA连接酶将DN*段与载体连接，然后转化宿主大肠杆菌，最后筛选出含有所需结构的重组质粒。
克隆分析用于将DN*段从一个载体（质粒、黏粒或噬菌体）转移到另一个载体上。它们通常用于构建表达系统，或是将DN*段转移到特殊的载体上以制备杂交探针或是制备测序用的单链模板。典型的载体含有三个必要的元件：一个抗生素抗性标记、一个复制起点（以便选择转化了的大肠杆菌宿主）以及一个或多个可供插入外源DN*段的*酶切位点。
基本的亚克隆操作包含四步：首先用合适的*性内切酶切割载体与插入片段，接着用T4DNA连接酶将DN*段与载体连接，然后转化宿主大肠杆菌，最后筛选出含有所需结构的重组质粒。
连接仅仅包含两段线型DNA分子的连接，通常形成环状的重组分子。当载体与插入片段具有同样黏性末端时，插入片段以相等的比例形成插入方向相反的两种重组分子。如果用产生不相同末端的两种*酶对载体和插入片段分别作双酶切时，插入片段就只能以一个方向与载体进行连接。
表型筛选的方法非常有效并且易于进行，当载体的克隆位点或是多聚接头位点存在于第二个表型标记内部时即可进行表型筛选，片段插入到这些位点后通常会使标记失活。第二个标记可以是抗生素的抗性基因，例如在pBR322中的抗性基因。在这种情况下携带重组质粒的转化子印影到含有第二种抗生素的平皿上便不能生长，但可以从母平皿上回收得到。
（一）*性核酸内切酶
核酸*性内切酶能够专一识别DNA双链上某碱基顺序（图4-1）。我们知道如果设计单位点酶切，质粒DNA与PCR扩增产物都会产生两个相同的粘性突出末端的线状分子，通过连接，就会产生不同方向性连接的重组质粒，也就产生了另一个问题，不同方向性的连接产生的结果一样吗？为了避免这个问题，所以我们的实验设计了两个位点酶切，保证了连接的单向性。
核酶*性内切酶作用于底物DNA时，受到许多要素的制约：
（1）底物DNA样品的纯度：在制备DNA样品中，由于各种条件的影响，存在着一些非DNA物质，这些物质有的对酶切反应影响较大，如抽提过程中，有机物质的残留成份，如酚、氯仿、酒精，都会破坏酶的活性，另外未除去的蛋白质，也会干扰酶的反应，残留的染色体DNA则会相对降低酶对底物DNA的浓度。
（2）离子浓度：*性核酸内切酶专一性需要镁离子，以作为辅基。并且要求一定的盐离子浓度，在使用上，通常把*性核酸内切酶对盐离子的要求分为三类，即高盐、中盐和低盐，它们所需的Na+分别为100mmol/L、50mmol/L和10mmol/L。如果离子浓度使用不当，酶反应不完全或会使酶的识别位点发生改变，例如高盐类的EcoRI酶当Na+离子浓度低于50mmol/L时，它的专一性就降低。只能识别中间的4个核苷酸序列（此活性记为EcoRI*）由于EcoRI酶切反应需要高盐缓冲液，在中盐缓冲液中反应比较慢，HindIII酶切反应需要中盐缓冲液，实验要求EcoRI与HindIII酶同时消化DNA时，而酶切反应要完全，则选用了中盐缓冲液。中盐缓冲液虽然对EcoRI酶的效果有一些影响，但总体上还是可行的。还有一种方法就是先用中盐缓冲液的HindIII酶切，再用高盐缓冲液的EcoRI酶切，效果可以更好。但课堂实验受时间约束，所以选用了双酶切。
（3）底物DNA的量：商品*性内切酶以酶单位计算，一个酶单位的定义是，即在规定的温度和缓冲液内，于20μL反应液内1h完全消化1μgDNA所需要的酶量。所以若是底物DNA的量超过酶的酶单位所规定的消化量，则反应不能完全。不过商品酶多是浓溶液，每μL含10单位以上，价格昂贵，所以使用时要尽量节省。
（4）酶反应温度与酶反应终止：大部分*性核酸内切酶最适的反应温度在37℃，极个别在60℃，所以酶反应后要使酶的活性失活时，可把反应液置于65℃内保温10-15min，以终止酶反应，但此法对个别酶（最适温度在60℃的酶）不适合。
（5）酶反应时间：酶消化时间通常依酶的浓度，底物的浓度和纯度而定，通常是30min到2h，甚至更长些，但不能过长。因为商品酶极有可能含有杂酶，时间过久，微量的杂酶的酶反应也会积累到干扰整个酶反应的程度。
（二）连接反应的原理
在体外用EcoRI与HindIII两种酶切载体质粒DNA与PCR产物，均产生了两种不同的粘性末端，这些相同的粘性末端之间可以由氢键相连接，但在两个氢键相连的片段之间5′磷酸和3′羟基未能连上，仍有缺口，本实验通过T4
DNA连接酶（图4-2）反应，把这些缺口以共价键连接起来，构成完整的嵌合质粒。
T4
DNA连接酶是由T4噬菌体DNA编码的酶，可以连接双链分子中3′羟基和5′磷酸，补上其缺口。它的作用步骤如下：
（1）T4
DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物（腺苷酰酶）。
（2）酶-AMP复合物再结合到具有5′-磷酸基和3′-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。
（3）产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
影响T4DNA连接酶的主要因素有以下：
（1）连接酶的用量
在一般情况下，酶的用量大，浓度高，反应速度快，反应连接物多，若所使的连接酶浓度太稀，要加进大量的连接酶。而商品连接酶是保存在50%甘油中，因此连接反应液中加入的酶量太大，则反应系统甘油含量过高，反而抑制酶的活性，影响连接效果，特别是含有杂酶的连接酶，加入量越大，影响就更大。
（2）作用时间和温度
T4
DNA连接酶的最适温度是37℃，但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合不稳定。EcoR I与Hind
III酶所产生的粘性末端，只通过四个碱基对相结合，这不足以抵抗该温度下的热运动，因此在实验操作时，DNA分子粘性末端的连接反应，其最适温度是采取催化反应与末端粘合反应温度的折中，一般采用12-15℃，反应时间为一昼夜。也可采取4-5℃，反应时间为一个星期，同样也得到良好的效果。
（3）底物的浓度问题
一般采用提高DNA的浓度来增加重组DNA分子的比例，DNA浓度太稀，质粒自连比率将会上升。当底物浓度过高时，连接效果也很差，这可能是分子运动受到阻挠。载体DNA和外源基因的比例也要合适，否则将会降低重组分子的机率。
（4）其它干扰因素
反应液中残余微量物质也可能干扰酶反应，例如，EDTA的存在会抑制酶的活性。DNA样品中如有蛋白质，RNA存在，也会妨碍连接酶与DNA的直接作用。所以反应时，所用的器皿和试剂都应是干净的和高纯度。
（三）感受态细胞的制备
所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0的100mmol/L
CaCl2（图4-3）中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24h，转化率测恢复为原来的水平。
（四）重组子的转化
我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞，接下的实验是把重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C600或DH5α，必须不同外来DNA分子发生遗传重组，通常是rec基因缺陷型的突变体，同时它们必须是*系统缺陷或*与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的DNA分子不会受其*酶的降解。保持外来DNA分子在受体细胞中的稳定性。制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷（r-km-krec-）同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感（Amp）。在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素（Amp）基因存在，当它导入受体细胞后，就赋于这些受体细胞新的特性，即Amp抗性。同时载体质粒上具有乳糖操纵的β-半乳糖苷酶基因（lacZ），我们可以利用外源基因插入载体β-半乳糖苷酶基因，使其失去β-半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。
把外来重组分子和感受态细胞在低温下混合，使其进入受体细胞。DNA分子转化的原理较复杂：吸附——完整的双链DNA分子吸附在受体菌表面；转入——双链DNA分子解链，单链DNA分子进入受体菌，另一链降解；自稳——外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA；表达——供体基因随同复制子同时复制，并被转录和翻译。
对DNA分子来说，能被转化进受体细胞的比率极低，通常只占DNA分子的0.01%，改变条件，提高转化率是很有可能的，一些研究表明下列因素可以提高转化率：（1）受体菌细胞与DNA分子两者比例在1.6×108细胞：1mg
DNA分子（4.3Kb）左右转化率较好；（2）DNA分子与细胞混合时间为1h最佳；（3）铺平板条件会影响转化率；（4）对不同转化菌株热处理（效应不一致）。
除上述因素外，转化试验还注意如下问题：
（1）连接DNA反应液与受体细胞混合时，一定保持在冰浴条件下操作，如果温度时高时低，转化效率将极差。
（2）热处理2min后，要迅速加进1mL
LB以使表型表达，延迟加LB，将使转化率迅速降低。
（3）在平板上涂布细菌时，注意避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械压涂布将会使细胞破裂。影响转化率。
（五）蓝白班筛选
目前实验使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β-半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列，此结构称为lacZ基因。lacZ基因编码的α肽链与失去正常氨基末端的β半乳糖苷酶突变体互补，产生具有功能活性的β-半乳糖苷酶分子，这种现象称为α互补。在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）的诱导下，β-半乳糖苷酶能将X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带lacZ基因的质粒载体转化到β-半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，都会在涂有IPTG和X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。当有外源DN*段插入到位于lacZ中的多克隆位点后，就破坏了α肽链的阅读框，从而无法形成α互补，不能产生具有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有外源DN*段的重组子的克隆在涂有IPTG和X-gal的培养基平板上是白色菌落（图4-4）。
